El hidrogel termosensible junto con el fosfato de ascorbilo de sodio promueve el cordón umbilical humano

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11909 (2023) Citar este artículo

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Se considera que la escasa supervivencia y la función restringida de las células madre trasplantadas limitan en gran medida su eficacia en la recuperación de heridas. En consecuencia, es necesario identificar estrategias terapéuticas innovadoras para resolver estos problemas. En primer lugar, se evaluó el efecto biológico del hidrogel PF-127 solo y en combinación con SAP sobre la supervivencia y la migración de HUCMSC cultivadas mediante ensayos de viabilidad celular, apoptosis y heridas por raspado. Se utilizaron S. aureus y E. coli para evaluar la actividad antibacteriana de la combinación PF-127 más SAP. Además, se evaluó la capacidad del medio acondicionado con HUCMSC (HUCMSC-CM) para promover la angiogénesis y la migración de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) in vitro mediante ensayos de formación de tubos y migración transwell. Finalmente, las HUCMSC incrustadas en el andamio PF-127 más SAP se administraron en el lecho de la herida cutánea por escisión de los ratones. Se emplearon análisis histológicos e inmunohistoquímicos para investigar la capacidad de cicatrización de heridas, así como las respuestas celulares del hidrogel PF-127/HUCMSCs/SAP. PF-127 mostró citotoxicidad en HUCMSC, mientras que la adición de SAP promovió significativamente la viabilidad celular y alivió la apoptosis de HUCMSC encapsuladas en hidrogel PF-127 in vitro. La suplementación con SAP anuló sustancialmente el efecto inhibidor de PF-127 sobre la migración de HUCMSC in vitro. La combinación de PF-127 y SAP ejerció una función bacteriostática obvia en S. aureus y E. coli. Además, el tratamiento conjunto con SAP podría mejorar notablemente el efecto estimulante de las HUCMSC-CM sobre la angiogénesis y la migración de las HUVEC in vitro. El trasplante de HUCMSC combinado con SAP PF-127 dio como resultado un proceso de curación de heridas potentemente acelerado, promovió la cantidad de células en proliferación y vasos sanguíneos recién formados, así como una mayor expresión del factor de crecimiento endotelial vascular. PF-127 junto con SAP contribuye al cierre de heridas traumáticas mediado por HUCMSC en ratones al promover la supervivencia celular, la acción antibacteriana y la angiogénesis. Nuestros resultados ofrecieron una base teórica para el tratamiento clínico de defectos traumáticos de la piel.

Las lesiones traumáticas de la piel pueden provocar la destrucción de la integridad estructural y funcional del tejido cutáneo normal1. Las lesiones cutáneas superficiales que solo dañan la epidermis pueden autocurarse completamente, mientras que las heridas cutáneas profundas que dañan la dermis subyacente exhiben una capacidad de autorreparación restringida, infección microbiana grave y cicatrices fibróticas anormales2. El tratamiento de lesiones cutáneas graves, como heridas cutáneas grandes, lesiones cutáneas graves y quemaduras cutáneas, a menudo requiere cirugía de desbridamiento, suplementación con factores de crecimiento o terapia de presión negativa con apósitos bioactivos para heridas3,4. Sin embargo, la eficacia terapéutica de estos tratamientos a menudo parece insatisfactoria para muchos pacientes.

Hoy en día, la terapia basada en células madre mesenquimales (MSC) ha sido reconocida como un enfoque eficaz para la regeneración de tejidos y la cicatrización de heridas mediante el reclutamiento de epitelio, la promoción de la angiogénesis y la regulación de la inflamación5,6. En particular, las MSC derivadas del cordón umbilical humano (HUCMSC) se encuentran entre las más utilizadas en ensayos clínicos y preclínicos debido a su repetitividad recolectada, su proceso de recolección menos invasivo y su mayor rendimiento de MSC. Las HUCMSC se consideran fuentes celulares ideales de medicina regenerativa debido a su mayor longevidad, mayor capacidad proliferativa y mayor capacidad de diferenciación celular que otras MSC7,8,9. En investigaciones previas sobre la regeneración de heridas, el método común de administración de MSC es la inyección. Al mismo tiempo, la eficacia terapéutica se vio limitada por un injerto deficiente, una retención corta y una supervivencia baja de las MSC trasplantadas10,11,12.

Debido a los recientes avances en la investigación de ingeniería de tejidos, la combinación de MSC con andamios basados ​​en biomateriales que extienden el tiempo de supervivencia de las MSC en el microambiente de la herida ha servido como una alternativa prospectiva para rejuvenecer las heridas. Pluronic F-127 es un hidrogel sensible al calor que existe como líquido a bajas temperaturas y como gel semisólido cuando la temperatura aumenta13. La degradación de PF-127 es rápida después de ser trasplantado in vivo y casi sin efectos secundarios en el huésped. La FDA de EE. UU. ha autorizado el PF-127 para la utilización clínica de células madre14. Las MSC de gelatina de Wharton encapsuladas en hidrogel PF-127 pueden promover significativamente la curación de heridas diabéticas en ratones15. Wen et al. utilizaron PF-127 para administrar las MSC a la fusión espinal en conejos e informaron que el compuesto era superior a las MSC solas16. Otro estudio informó que PF-127 fue beneficioso para retener vesículas extracelulares derivadas de células estromales, y la aplicación de PF-127 mejoró la reparación y regeneración de la fístula esofágica articular17. Sin embargo, existen obstáculos para la aplicación de PF-127 para tratar heridas cutáneas debido a que se ha informado que PF-127 tiene un efecto citotóxico sobre la supervivencia de las células encapsuladas15,18,19. Un estudio sobre la reducción de la citotoxicidad de PF-127 demostró que el suministro de un agente estabilizador de membrana puede promover notablemente la viabilidad de las MSC en PF-12720.

Como sal sódica del 2-fosfato del ácido ascórbico, el ascorbilfosfato sódico (SAP) puede mantener una alta estabilidad incluso cuando se expone a especies reactivas de oxígeno y a una solución acuosa durante un tiempo prolongado21. Se encontró que SAP ejercía múltiples actividades farmacológicas, como acciones antioxidantes, antiinflamatorias, inmunoestimulantes y antibacterianas22. La propiedad antioxidante de la SAP ha sido profundamente investigada últimamente23. También se ha demostrado que SAP posee capacidades antioxidantes y antiinflamatorias mejoradas contra diversos modelos de enfermedades cuando se combina con biopolímero de ácido hialurónico24. Además, la suplementación con SAP mejora en gran medida la viabilidad de las MSC de gelatina de Wharton incrustadas en PF-127 y acelera la cicatrización de heridas diabéticas en ratones15. Sin embargo, los estudios que exploran los efectos de SAP en HUCMSC encapsulados en hidrogel PF-127 son escasos y el mecanismo molecular subyacente sigue siendo en gran medida desconocido.

Esta investigación tuvo como objetivo determinar la influencia de SAP en la supervivencia de HUCMSC en encapsulación de PF-127. En el presente estudio se evaluaron los beneficios terapéuticos del hidrogel PF-127/HUCMSCs/SAP en el modelo de herida cutánea y también se investigaron sus mecanismos moleculares subyacentes.

La línea HUCMSC Saliai-HMSC (UC)-N se adquirió de Guangzhou Saliai Stem Cell Co., Ltd. La línea celular HUCMSC se cultivó en medio DMEM/F12 (Life Technologies, Carlsbad, CA) y se cultivó en una incubadora humidificada con 5 % CO2 mientras se alimentaba con 10% de FBS (Gibco, EE. UU.). Los HUVEC se obtuvieron del Banco de la Academia de Ciencias de China. Las HUVEC se cultivaron en un medio MEM-alfa (Gibco, EE. UU.). Para el experimento se utilizaron células en fase logarítmica.

Se adquirieron ratones macho C57BL/6 de 8 semanas de edad (25 ~ 30 g) de Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co., Ltd (Changsha, China) y también se alojaron en grupo a una temperatura estable (18 ~ 22 °C). como humedad (50~60%). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Central de Yueyang para el uso de animales y se realizaron de acuerdo con las Directrices de uso y cuidado de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El experimento con animales cumple con los lineamientos de ARRIVE y de acuerdo con la guía de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

La preparación de hidrogel de PF-127 al 20% y la encapsulación de células madre se realizaron de acuerdo con el informe anterior15,19. En resumen, el polvo de PF-127 (Sigma, EE. UU.) se disolvió en medio DMEM-F12 preenfriado para preparar una solución de PF-127 al 20 % (p/v). La solución de PF-127 se aclaró con filtros de jeringa (0,2 μm) y se almacenó en condiciones de 4 °C. Las HUCMSC se encapsularon en una solución de PF-127 al 20 % con 400 µM o 800 µM de SAP (Sigma, EE. UU.) para formar el hidrogel PF-127/HUCMSC/SAP, y el híbrido se colocó en una incubadora a 37 °C durante 15 minutos para hacer transformación en gel.

Las características de flujo del hidrogel PF-127/HUCMSC/SAP sensible a la temperatura se observaron y fotografiaron a 20 y 37 °C, respectivamente. Las propiedades reológicas del hidrogel PF-127/HUCMSC/SAP se midieron utilizando un reómetro rotatorio (Kinexus, Malvern) con una amplitud de deformación del 1% y una frecuencia de 0,159 Hz. Se utilizó un microscopio electrónico de barrido (SEM) Zeiss para observar la morfología microestructural del hidrogel PF-127 y del hidrogel HUCMSC/PF-127/SAP.

Se cultivaron HUCMSC (1 x 106) en placas de 6 pocillos durante la noche y el medio se reemplazó por medio DMEM/F12 sin suero con L-glutamina 2 mM (Gibco). Las HUCMSCs-CM se recogieron 24 h después y se clarificaron utilizando un filtro de 0,22 μm. El HUCMSCs-CM se mantuvo en un refrigerador a -80 °C.

Para medir la viabilidad celular, se cultivaron 1 × 104 HUCMSC con diferentes condiciones de encapsulación en placas de 96 pocillos durante la noche, y se agregaron 10 µl de reactivo CCK-8 (Beyotime, Beijing) a cada pocillo y se incubaron a 37 °C durante media hora. . Luego se analizó la absorbancia a 450 nm mediante un lector de microplacas.

La apoptosis celular se determinó en HUCMSC utilizando el método de tinción DAPI (BioVision, EE. UU.). Se cultivaron 5 × 104 HUCMSC con diferentes condiciones de encapsulación en una placa de 48 pocillos durante 24 h. Las HUCMSC se fijaron y permeabilizaron, después de lo cual se tiñeron con DAPI durante 10 minutos. Luego, los resultados se observaron y capturaron utilizando un microscopio de fluorescencia invertido (DCM8, Leica, Alemania). Seleccione aleatoriamente 20 campos de visión, calcule la proporción de células apoptóticas y calcule el valor promedio.

Se cultivaron 1 x 105 HUCMSC con diferentes condiciones de encapsulación en placas de 6 pocillos y se incubaron en un medio libre de FBS durante 24 h. Luego, se empleó una punta de pipeta de 10 µL para trazar una línea recta en la monocapa celular. Se tomaron imágenes de HUCMSC en el momento indicado y el software Image J calculó la tasa de migración celular. Los datos se han informado como el grado de cierre de la herida por el ancho del rasguño inicial.

Las HUVEC se incubaron en medio MEM-alfa sin suero con o sin HUCMSC-CM durante 12 h. Se diluyeron 100 μl de Matrigel (BD Biosciences) con medio MEM-alfa y se recubrieron en placas de 6 pocillos a 37 °C durante 1 h. Luego, se sembraron 5 × 104 HUVEC en Matrigel. Las placas de 6 pocillos se transfirieron nuevamente a la incubadora durante la noche. La capacidad de formación de tubos de las HUVEC se fotografió y cuantificó mediante microscopía invertida de contraste de fase.

Se incubaron 2,5 x 104 HUVEC en 500 μl de medio MEM-alfa sin suero y se agregaron a la cámara superior en placas Transwell de 24 pocillos (Corning, EE. UU.). La cámara inferior se recubrió previamente con PF127 con o sin SAP, y en la cámara inferior se colocaron 750 µl de medio completo con o sin HUCMSC-CM. Después de 12 h de incubación, la superficie inferior de las HUVEC se tiñó con cristal violeta durante 15 min. Finalmente, las HUVEC migradas fueron fotografiadas y contadas con un microscopio.

Se añadieron 100 µl de solución de hidrogel a una placa de 24 pocillos. Se suministró 1 ml de suspensión de S. aureus y E. coli (1 x 104 UFC/ml) a la placa de 24 pocillos recubierta con hidrogel y se incubó durante otras 12 h. Finalmente, se aplicaron 100 μL de la solución bacteriana anterior a placas de agar LB y se colocaron a 37 °C durante 24 h. La unidad formadora de colonias (UFC) en las placas se contó y calculó de acuerdo con la literatura previa25.

El modelado de heridas cutáneas de espesor total en ratones se realizó como se informó anteriormente12. En resumen, los ratones fueron anestesiados y colocados boca abajo en la mesa de operaciones. Después de afeitar sucesivamente el pelo de la zona de la espalda con tijeras eléctricas y cera depilatoria, se realizó una herida redonda de espesor total con un diámetro de 12 mm con un punzón de biopsia en la parte posterior de cada ratón. Todos los ratones fueron asignados aleatoriamente a ciegas en cuatro grupos (n = 6): (1) grupo de control (50 μL de medio DMEM-F12), (2) grupo PF-127 (50 μL de solución PF-127 al 20%), (3) Grupo PF-127/HUCMSC (1 × 106 HUCMSC se incluyeron en 50 μL de solución de PF-127 al 20%), (4) grupo PF-127/HUCMSC/SAP (1 × 106 HUCMSC y 400 μM de SAP se encapsularon en 50 μL 20 % solución PF-127). Todos los fármacos se aplicaron localmente en el sitio de la herida una vez al día. El sitio de la herida fue observado y fotografiado los días 0, 3, 6, 9, 12 y 15 después de la cirugía. Los ratones fueron sacrificados 15 días después de la cirugía, luego el área del lecho de la herida y las muestras circundantes se diseccionaron inmediatamente para su posterior análisis.

Los tejidos resecados se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 15 minutos, luego se incluyeron en parafina, se cortaron en secciones delgadas y se tiñeron con HE y el kit de tinción Masson, respectivamente. Las secciones se observaron bajo un microscopio óptico (Olympus, Japón).

Los tejidos de la piel se inmovilizaron en formaldehído al 4%, se deshidrataron, se incluyeron y se cortaron en secciones. Después de las reparaciones con tampón citrato de sodio 10 mM (pH 6,0, Beyotime) a 94 °C durante 15 minutos, las secciones se enfriaron a temperatura ambiente y se sellaron con albúmina sérica bovina al 1% (BSA, Beyotime) durante 30 minutos. Posteriormente, las secciones se trataron con anticuerpos primarios dirigidos a Ki-67, CD31 y VEGF (Abcam). A continuación, las secciones se incubaron con anticuerpos secundarios marcados con biotinilación y se volvieron a teñir con hematoxilina. Las secciones teñidas finalmente se capturaron bajo un microscopio óptico (Olympus, Tokio, Japón).

Las pruebas estadísticas se realizaron mediante GraphPad Prism 6.0. Las diferencias entre dos o más grupos se compararon mediante el ANOVA unidireccional seguido del postest de Tukey. Una p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativa.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Central de Yueyang para el uso de animales y se realizaron de acuerdo con las Directrices de uso y cuidado de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El experimento con animales cumple con los lineamientos de ARRIVE y de acuerdo con la guía de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

Como se muestra en la Fig. 1A, el hidrogel PF-127/HUCMSCs/SAP es líquido y casi transparente a bajas temperaturas. Con el aumento gradual de la temperatura (20 ~ 37 °C), el hidrogel termosensible se transforma en un gel semisólido con un fuerte aumento de la absorbancia. Además, exploramos las características físicas del hidrogel PF-127/HUCMSCs/SAP mediante mediciones reológicas del módulo elástico (G′) y del módulo viscoso (G″) al aumentar la temperatura de 15 °C a 45 °C. Los resultados mostraron que la temperatura de gelificación inicial del hidrogel PF-127/HUCMSCs/SAP fue de aproximadamente 20 °C (Fig. 1B). Las características morfológicas de los hidrogeles se observaron mediante SEM después de la liofilización (Fig. 1C). Tanto el hidrogel PF127 como el hidrogel PF-127/HUCMSCs/SAP presentaron microestructuras porosas interconectadas y similares. La estructura de red suelta y porosa exhibe la buena capacidad de absorción y transpirabilidad del hidrogel PF-127/HUCMSCs/SAP, que facilita la cicatrización de las heridas de la piel.

Caracterización del hidrogel PF-127/HUCMSCs/SAP. (A) Fotografías ópticas del hidrogel a diferentes temperaturas. (B) Propiedades reológicas del hidrogel F-127/HUCMSCs/SAP de 15 a 45 °C. (C) Imágenes SEM que demuestran la estructura porosa del hidrogel.

Determinar el papel biológico de SAP en HUCMSC encapsuladas en hidrogel PF-127. Las HUCMSC se cocultivaron en hidrogel PF-127 con o sin SAP durante 24 h y la viabilidad celular se determinó mediante el ensayo CCK-8. Como se muestra en la Fig. 2A, la viabilidad celular se redujo notablemente después de que las HUCMSC se encapsularon en hidrogel PF-127. El cotratamiento con SAP (400 μM) podría contrarrestar notablemente el efecto supresor de PF-127 sobre la viabilidad celular de las HUCMSC.

SAP mejora la supervivencia y migración de HUCMSC en la encapsulación PF-127. (A) Las HUCMSC se trataron con PF-127 o se combinaron con SAP, luego se determinó la viabilidad celular mediante el ensayo CCK-8. n = 6 muestras independientes. (B) La apoptosis de HUCMSC después de ser tratadas con PF-127 o combinadas con SAP se detectó mediante tinción DAPI. n = 20 muestras independientes. (C) Las HUCMSC se incubaron con PF-127 o se combinaron con SAP, y la migración de las HUCMSC se determinó mediante un ensayo de raspado de heridas celulares. n = 3 muestras independientes. ***P < 0,001 versus grupo control. ##P < 0,01, ###P < 0,001 frente al grupo PF-127. Todos los datos se presentan como media ± DE. Las barras de error representan SD.

Exploramos más a fondo si la apoptosis contribuyó a la muerte de HUCMSC causada por PF-127 (Fig. 2B). De acuerdo con los resultados del ensayo CCK-8, los resultados del ensayo de tinción DAPI mostraron que el porcentaje de HUCMSC encapsuladas con PF-127 positivas para DAPI fue significativamente mayor que el de las células de control. Se observa que el efecto promotor de PF-127 sobre la apoptosis de HUCMSC se vio atenuado por la suplementación de SAP (400 μM). Mientras que no hubo diferencias estadísticas en la regulación de la viabilidad celular y la apoptosis cuando la concentración de SAP se elevó a 800 μM. Estos descubrimientos demostraron que la adición de SAP mejora notablemente la viabilidad de las HUCMSC pero atenúa la apoptosis de las HUCMSC en la encapsulación de PF-127.

Luego exploramos si el SAP combinado con PF-127 promovía la migración de HUCMSC mediante un ensayo de raspado de heridas celulares. Como se anticipó, PF-127 inhibió notablemente la migración de HUCMSC (Fig. 2C). Mientras tanto, descubrimos que la migración de HUCMSC mejoró significativamente después de aplicaciones SAP de 400 μM o SAP de 800 μM en comparación con el grupo PF-127.

Como se muestra en la Fig. 3, PF-127 casi no ejerce ningún efecto inhibidor sobre el crecimiento de E. coli y S. aureus. El hidrogel PF-127/SAP ejerció una fuerte función bacteriostática; el número de colonias en el grupo PF-127/SAP (800 μM) fue el menos abundante en comparación con otros grupos. En conjunto, la combinación de PF-127 y SAP demostró poderosas propiedades antibacterianas contra bacterias Gram positivas y Gram negativas. Por lo tanto, estos hallazgos sugieren que el hidrogel PF-127/SAP podría mejorar la supervivencia de las HUCMSC y reducir el riesgo de infección de la herida.

Imágenes de E. coli y S. aureus incubadas con hidrogel PF-127 con diferentes concentraciones de SAP. **P < 0,01, ***P < 0,001 frente al grupo PF-127. #P < 0,05, ##P < 0,01 frente al grupo PF-127/SAP (400 μM). n = 3 muestras independientes. Los datos se presentan como media ± DE. Las barras de error representan SD.

Posteriormente, se emplearon ensayos de formación de tubos y migración transwell para investigar las características biológicas de HUVEC cultivadas con o sin HUCMSC-CM en diferentes condiciones de encapsulación. La formación de tubos y la migración de HUVEC no se vieron obviamente influenciadas después de la incubación con una solución de PF-127 al 20% (Fig. 4A, B). Las HUVEC cultivadas en PF-127/HUCMSC-CM formaron más túbulos por campo de visión (FOV) que las del grupo PF-127. El número de túbulos derivados de HUVEC se promovió aún más mediante el cocultivo con PF-127/HUCMSC/SAP-CM en comparación con el del grupo PF-127/HUCMSC (Fig. 4C).

La combinación HUCMSCs-CM más SAP restaura las disfunciones de las HUVEC in vitro. (A) Las HUVEC se trataron con o sin HUCMSC-CM en diferentes condiciones de encapsulación, luego la red de tubos se determinó mediante un ensayo de formación de tubos. n = 6 muestras independientes. (B) La migración de HUVEC después de ser tratadas con o sin HUCMSC-CM en diferentes condiciones de encapsulación se detectó mediante un ensayo de migración Transwell. n = 6 muestras independientes. (C) Análisis cuantitativo de la longitud total del tubo en el ensayo de formación de tubos. (D) Análisis cuantitativo de las células migradas en el ensayo de migración transwell. ###P <0,001 frente al grupo PF-127. ▲P < 0,05 versus el grupo PF-127/HUCMSC. Los datos se presentan como media ± DE. Las barras de error representan SD.

De manera similar, el ensayo de migración de Transwell mostró que, en comparación con el grupo PF-127, PF-127/HUCMSCs-CM promovió significativamente la cantidad de HUVEC migradas, y la adición de SAP mejoró aún más la migración de HUVEC inducida por PF-127/HUCMSCs-CM. (Figura 4D). Estos hallazgos mostraron que SAP podría mejorar aún más la restauración de la función HUVEC inducida por HUCMSC-CM.

Los experimentos anteriores han confirmado que PF-127 junto con SAP facilita el cierre de heridas mediado por HUCMSC in vitro. Se realizaron más estudios para explorar la hipótesis de que PF-127 más SAP podría contribuir a la cicatrización de heridas mediada por HUCMSC utilizando el modelo de herida cutánea de espesor total. De manera similar a nuestra predicción, en comparación con el grupo de control, se han observado notables efectos aceleradores de la recuperación de heridas cutáneas en el grupo de hidrogel PF-127. La aplicación de PF-127/HUCMSC provocó una mayor disminución en el área de la herida residual el día 9 después de la cirugía en comparación con el grupo PF-127 (Fig. 5). La herida en el grupo PF-127/HUCMSCs/SAP sanó mejor el día 9 después del trasplante que en los otros grupos. 15 días después de la cirugía, las heridas de la piel en el grupo PF-127/HUCMSCs/SAP sanaron casi por completo, mientras que otros grupos todavía tenían diversos grados de heridas visibles sin cicatrizar.

Imágenes representativas del proceso de cicatrización de heridas en cuatro grupos en el momento indicado. *P < 0,05 frente al grupo de PBS. #P < 0,05 frente al grupo PF-127. ▲P < 0,05, ▲▲P < 0,01 versus el grupo PF-127/HUCMSC. n = 6 muestras independientes. Los datos se presentan como media ± DE. Las barras de error representan SD.

Se realizó un análisis histológico para explorar más a fondo el efecto del hidrogel PF-127/HUCMSCs/SAP en la cicatrización de heridas. Como se ve en la Fig. 6A, 15 días después de la cirugía, la respuesta inflamatoria se puede observar en los cuatro grupos, mientras que la respuesta inflamatoria más grave se observó en el grupo PBS, que se caracteriza por un foco hemorrágico local, muchas células inflamatorias pero pocas. fibras de colágeno, una disminución sustancial del tejido conectivo. En el grupo de PF-127/HUCMSC, la inflamación disminuyó o disminuyó. En marcado contraste, los tejidos del grupo PF-127/HUCMSCs/SAP mostraron las células menos inflamatorias. El espesor de la dermis en el grupo PF-127/HUCMSCs/SAP fue más grueso que en otros grupos (Fig. 6B), junto con una capa de epitelio relativamente intacta y abundantes fibroblastos en la dermis. La tinción H&E también ilustró que el grupo PF-127/HUCMSCs/SAP exhibió un área de herida residual más pequeña que otros grupos en el día 15 después de la cirugía. Los datos estadísticos también verificaron que la cantidad de folículos pilosos recién nacidos fue notablemente mayor en todos los grupos de andamio en comparación con el grupo de control (Fig. 6C), y el grupo PF-127/HUCMSCs/SAP aún mostró la mayor cantidad de cabello. folículos.

PF-127 junto con SAP mejora la regeneración de la dermis mediada por HUCMSC en ratones. (A) Imágenes microscópicas ópticas de tinción H&E del lecho de la herida y del tejido normal circundante. (B) Análisis cuantitativo del espesor de la dermis curada en cuatro grupos. (C) Análisis cuantitativo del número de folículos pilosos recién nacidos en cuatro grupos. *P < 0,05 frente al grupo de PBS. ##P <0,01 frente al grupo PF-127. ▲▲P < 0,01 versus el grupo PF-127/HUCMSC. n = 6 muestras independientes. Los datos se presentan como media ± DE. Las barras de error representan SD. Barra de escala de 100 μm.

Además, la disposición de las fibras de colágeno en los tejidos del área de la herida se determinó mediante tinción de Masson. El presente estudio demostró que la proporción de fibras de colágeno depositadas en el área de la dermis regenerada en el grupo PF-127/HUCMSCs/SAP es mucho mayor que en otros grupos (Fig. 7).

Imágenes microscópicas ópticas de la tinción tricrómica de Masson del lecho de la herida y los tejidos normales circundantes. *P < 0,05 frente al grupo de PBS. #P < 0,05 frente al grupo PF-127. ▲P < 0,05 versus el grupo PF-127/HUCMSC. n = 6 muestras independientes. Los datos se presentan como media ± DE. Las barras de error representan SD. Barra de escala de 200 μm.

Exploramos más a fondo el mecanismo subyacente a la combinación de PF-127 más SAP que mejora la cicatrización de heridas mediada por HUCMSC. Ki-67, CD31 y VEGF, que están relacionados con la proliferación y la angiogénesis, se evalúan mediante tinción inmunohistoquímica. Como se muestra en la Fig. 8, las células positivas para Ki-67 en los tejidos del grupo PF-127/HUCMSC/SAP fueron significativamente mayores en comparación con otros grupos. Nuestro estudio mostró que la cantidad de vasos sanguíneos recién formados en el grupo PF-127/HUCMSCs/SAP aumentó significativamente que en los otros grupos. Además, se realizó la expresión de VEGF para evaluar la angiogénesis. Se pudieron encontrar células VEGF positivas en los cuatro grupos, mientras que su número de células positivas fue mayor en el grupo PF-127/HUCMSCs/SAP. Por lo tanto, estos resultados revelaron que la combinación de PF-127 más SAP mejora la cicatrización de heridas mediada por HUCMSC al promover la proliferación celular y la angiogénesis.

Imágenes microscópicas ópticas de tinción inmunohistoquímica de Ki-67, CD31 y VEGF en el lecho de la herida y los tejidos normales circundantes. *P < 0,05 frente al grupo de PBS. ##P < 0,01, ###P < 0,001 frente al grupo PF-127. ▲P < 0,05, ▲▲▲P < 0,001 versus el grupo PF-127/HUCMSC. n = 6 muestras independientes. Los datos se presentan como media ± DE. Las barras de error representan SD. Barra de escala de 100 μm.

Un material de apósito ideal para heridas no se limita a prevenir infecciones externas, sino también a guiar la infiltración de las células de la piel. Una permeabilidad al vapor adecuada, fácil eliminación y buena flexibilidad son requisitos esenciales para el apósito para heridas26,27. Entre estos diversos apósitos para heridas, los hidrogeles poliméricos ofrecen muchas ventajas, como buena hidrofilicidad, excelente biocompatibilidad y propiedades físicas ajustables, que se identifican como uno de los candidatos a material para apósitos para heridas más prometedores13. Como uno de los hidrogeles poliméricos más utilizados, la estructura porosa del PF-127 actúa como una barrera sólida contra infecciones externas, proporciona hidratación y absorbe extruidos14. En el presente estudio, la aplicación local del hidrogel PF-127 solo podría promover la cicatrización de heridas en la piel, pero el efecto podría ser más satisfactorio, similar a informes anteriores15,18,19. Recientemente, una estrategia basada en ingeniería de tejidos ha demostrado que la aplicación de andamios basados ​​en biomateriales junto con células madre, fármacos o factores biológicamente activos en la regeneración de heridas de la piel ha ganado más popularidad y atención10,11,12,13. En el presente estudio, el 20 % de PF-127 sirvió como sistema de administración para cargar los complejos HUCMSC/SAP, y se investigó el efecto terapéutico del hidrogel PF-127/HUCMSC/SAP sobre la cicatrización de heridas cutáneas de espesor total.

Muchos estudios básicos y clínicos han demostrado que las HUCMSC son un fármaco candidato prometedor para la cicatrización de heridas en defectos de la piel humana y animal debido a sus propiedades beneficiosas, como la estimulación de la angiogénesis, la regulación de la inmunidad y la promoción de la regeneración celular7,8. 9. Sin embargo, debido al escurrimiento de la suspensión de células madre después de la inyección tópica en el lugar del trasplante, menos del 1% de las células madre trasplantadas permanecen en el lugar de la inyección durante más de una semana. Por tanto, la eficacia terapéutica de las células madre se vio notablemente atenuada por un deficiente injerto celular. Para resolver este problema, se ha evaluado en profundidad la inclusión de células en estructuras basadas en biomateriales para confinar las células inyectadas en el lugar del trasplante sin que se escurran15,16,17. Los hidrogeles IVFK proporcionan sitios de unión celular para mioblastos de ratón, prolongando significativamente la supervivencia celular y apoyando su expansión y diferenciación en miocitos miotubos28. Se informó que la combinación de hidrogel de fibrina diseñado y MSC podría localizar más células en el sitio de la herida, lo que reveló mejores efectos de reparación de heridas que el trasplante de MSC solo29. Otro estudio demostró que las células madre encapsuladas en hidrogel de quitosano mantuvieron una alta densidad celular durante mucho tiempo, y esta combinación promovió significativamente la curación de heridas30. La característica termosensible del hidrogel PF-127 facilita la unión y retención de las células en el lugar del trasplante, lo que llevó a que PF-127 se utilizara ampliamente en el campo de la regeneración de tejidos14. En nuestro estudio, el hidrogel PF-127/HUCMSC se pudo rellenar adecuadamente en heridas cutáneas irregulares de manera uniforme en estado de solución. Después del trasplante sobre los defectos de la piel, la fluidez del hidrogel PF-127/HUCMSC disminuyó gradualmente con el aumento de temperatura. El hidrogel eventualmente se condensa y separa el defecto de la piel del ambiente externo para reducir la posibilidad de infección de la herida. La aplicación de PF-127/HUCMSC acelera notablemente la reparación de las heridas de la piel en comparación con el grupo PF-127. Al mismo tiempo, PF-127 puede aumentar el nivel de expresión de ROS intracelular, lo que produce efectos citotóxicos en las células encapsuladas15,18,19. De acuerdo con estos hallazgos, los resultados del estudio actual revelaron consistentemente que la supervivencia y la migración de HUCMSC encapsuladas se atenuaron significativamente después de la incubación en hidrogel PF-127 al 20% durante 24 h. Por lo tanto, la escasa supervivencia celular y las características biológicas de las MSC en la encapsulación de PF-127 fueron otros obstáculos que limitaron la eficacia terapéutica de las células madre.

Los investigadores han realizado muchos intentos para mejorar el efecto terapéutico de las células madre trasplantadas. Un estudio reciente ha demostrado que la luz OLED roja puede mejorar la angiogénesis, la adhesión celular y las capacidades de migración de las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano31. Muchos estudios se han centrado en la adición de agentes estabilizadores de la membrana celular al hidrogel PF-127 para mejorar la supervivencia celular. Generalmente se añadió hidrocortisona al gel PF-127 para mejorar la viabilidad celular, como las células HepG2 y HMEC-132. Sin embargo, la hidrocortisona tiene un efecto inmunosupresor en el cuerpo, lo que afecta negativamente a la recuperación de la herida. Mientras tanto, la aplicación de vitamina C como producto natural puede aumentar la viabilidad de las BMSC encapsuladas en PF-12732. La vitamina C tiene un poderoso efecto antioxidante y la vitamina C por sí sola puede inhibir eficazmente el crecimiento bacteriano y promover la recuperación de heridas, por lo que es un estabilizador ideal de la membrana celular33. Como un tipo de análogo de la vitamina C, la SAP se caracteriza por una mayor estabilidad físico-química que el ácido ascórbico21. Este estudio también observó que SAP puede inhibir eficazmente el crecimiento bacteriano in vitro. Además, la suplementación con SAP atenúa el efecto citotóxico de PF-127 y mejora la supervivencia celular en la encapsulación de MSC de rata15. Dado que SAP tiene una fuerte capacidad de eliminación de ROS, planteamos la hipótesis de que agregar SAP a PF-127 puede mejorar la supervivencia de los HUCMSC incrustados, aumentando así el efecto de reparación de los HUCMSC en las heridas de la piel. Nuestros resultados confirmaron esta conjetura. En el presente estudio, los ensayos de CCK-8 y apoptosis demostraron que SAP 400 μM promovió en gran medida la supervivencia de HUCMSC encapsuladas en PF-127. Nuestros datos in vivo revelaron que PF-127 más SAP 400 μM contribuyó significativamente a la cicatrización de heridas de espesor total mediada por HUCMSC, la regeneración de la dermis y la proliferación celular en ratones. Estos hallazgos in vivo son paralelos a las alteraciones encontradas in vitro. El estudio actual revela por primera vez que el compuesto PF-127 y SAP mejoran la eficacia de la cicatrización de heridas mediada por HUCMSC tanto in vitro como in vivo. Proponemos que PF-127 mejora el tiempo de residencia in situ de los HUCMSC, así como el efecto antioxidante de SAP, lo que contribuye al gran efecto de curación de heridas del hidrogel PF-127/HUCMSC/SAP, mientras que el mecanismo subyacente aún no está claro.

La formación de nuevos vasos sanguíneos juega un papel vital en la orquestación de la curación de heridas. La naturaleza no curativa de las heridas crónicas se puede atribuir principalmente a una angiogénesis alterada, que no logra suministrar nutrientes adecuados al sitio lesionado34. Varias líneas de evidencia sugieren que la estimulación de la angiogénesis es un mecanismo esencial por el cual las MSC aceleran la recuperación de la herida34,35,36. La proliferación y migración de células endoteliales se consideran dos pasos críticos en la angiogénesis34. En experimentos in vitro, encontramos que la formación de tubos y la migración de HUVEC no se vieron influenciadas significativamente por PF-127, lo que demostró la biocompatibilidad del hidrogel PF-127. Estudios recientes han demostrado que las células madre pueden liberar una variedad de moléculas bioactivas, como factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas, matriz extracelular (MEC) y moléculas pequeñas. Estas moléculas bioactivas están presentes en la CM o secretomas, y las células madre utilizan estas moléculas bioactivas para ayudar a la regeneración de tejidos37. Nuestros resultados mostraron que HUCMSC-CM podría promover la angiogénesis y la migración de HUVEC in vitro, lo que sugiere que las HUCMSC pueden promover la recuperación funcional de las células endoteliales vasculares a través de efectos paracrinos. Este enfoque acelular tiene enormes ventajas sobre las opciones de tratamiento tradicionales y, por lo tanto, está recibiendo cada vez más atención. Además, el efecto proangiogénico de las HUCMSC se ve reforzado aún más por la aplicación de SAP in vitro e in vivo; Estos resultados son similares a informes bibliográficos anteriores38. Aún no se conoce el mecanismo de señalización por el cual las HUCMSC promueven la angiogénesis.

El VEGF es un factor definitivo que promueve la permeabilidad de los capilares, la mitogénesis y migración de las células endoteliales vasculares, la degeneración de la matriz y la formación de tubos vasculares39. Se ha empleado VEGF solo o en combinación con otra terapia para tratar heridas crónicas40. Nuestro estudio mostró que el nivel de proteína de VEGF, que casi no tenía expresión en las heridas del grupo PF-127, aumentó notablemente en los grupos PF-127/HUCMSC y PF-127/HUCMSC/SAP, lo que coincide con la tinción de inmunotinción. resultados de CD31. En conjunto, el hidrogel PF-127/HUCMSCs/SAP puede promover eficientemente la angiogénesis de heridas traumáticas en la piel, y el nivel de VEGF promovido juega un papel vital en la aceleración de la angiogénesis, promoviendo así la reparación del tejido.

En conjunto, el presente estudio revela una estructura de hidrogel novedosa y eficaz para administrar HUCMSC para tratar el defecto cutáneo traumático. SAP se identifica como un agente estabilizador de la membrana celular eficaz que mejora drásticamente la supervivencia de las HUCMSC encapsuladas en PF-127 mediante la promoción de la proliferación celular, la acción antibacteriana y la neovascularización, y la regulación positiva del VEGF puede desempeñar un papel crucial en las PF-127/HUCMSC. / Cicatrización de heridas inducida por SAP. Nuestros resultados mostraron que el hidrogel PF-127/HUCMSCs/SAP mostró una gran actividad biológica y propiedades antibacterianas y tiene un potencial excelente para acelerar la cicatrización de heridas, especialmente en heridas infectadas.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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LL diseñó el estudio, completó el experimento y supervisó la recopilación de datos. SYXM analizó los datos e interpretó los datos. ZF y CY prepararon el manuscrito para su publicación y revisaron el borrador del manuscrito. YZ escribió este manuscrito. Todos los autores han leido y aprobado el manuscrito.

Correspondencia a Yan Zhang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Liu, L., Yao, S., Mao, X. et al. El hidrogel termosensible junto con ascorbilo fosfato de sodio promueve la curación de heridas en la piel mediada por células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano en ratones. Informe científico 13, 11909 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38666-w

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Recibido: 03 de mayo de 2023

Aceptado: 12 de julio de 2023

Publicado: 24 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38666-w

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